Giris

Kompleks bir ekosistem olan insan barsak mikroflorasi hem barsakta zararli bakterilerin çogalmasini engeller hem de yiyeceklerin sindirim islemlerinde rol oynar. Barsakta trilyonlarca bulunan flora bakterileri çok çesitlidir ve farkli enzim aktiviteleri gösterir (1). Bir mikroorganizmanin barsakta hakim olmasi sonucu bakterinin enzim aktivitesini arttirarak gastrointestinal sistemin fonksiyonlarini (intestinal bariyer, immüne yanit gibi) etkileyebilecegi düsünülmektedir. Enflamatuvar barsak hastaligi, irritabl barsak sendromu, atopik dermatit, romatoid artrit ve ankilozan spondilit, kolon kanseri gibi hastaliklarda normal intestinal mikrofloranin ve aktivitesinin hasta olmayan bireylerden farkli oldugunu gösteren çalismalar vardir (2,3). Günümüzde barsak mikroflorasinda bulunan bakteriler kültür, floresan in situ hibridizasyon, polimeraz zincir reaksiyonu, sekanslama (16S ribozomal ribonükleik asit amplikonlarinin direk sekanslanmasi, pirosequencing ve microbiome shotgun sekanslamasi) yöntemleri ile saptanmakta, direk mikroflorada bulunan bakteriler koloni sayilari ile ifade edilebilmektedir. Diski enzim aktiviteleri kolon florasinda yasayan bakterilerin varligini ve metabolik aktivitelerini yansitan dolayli bir belirteçtir. Mikrofloranin niceliksel kompozisyonunu ve etkilesimini göstermesi açisindan degerlidir (3). Diskida ölçülebilen enzimler arasinda beta (β)-glukuronidaz, β-glukozidaz ve üreaz yer almaktadir (4,5). β-glukozidaz ve üreaz bazi bakteri türlerinin ürettigi yapisal enzimlerdir ve barsakta bu bakterilerin varligini yansitir. Buna karsilik β-glukuronidaz substrati varliginda indüklenen, bakterinin metabolik durumunu yansitan bir enzimdir (6). β-glukuronidaz ve β-glukozidaz aktivitesinin artmasi toksik ve karsinojenik maddelerin enterohepatik sirkülasyona geçme olasiliginin arttigini gösterir (4). Üreaz üreten mikroflora bakterileri arasinda Bifidobacterium, Clostridium, Eubacterium ve Fusobacterium türleri yer alir (7). β-glukuronidaz üreten mikroorganizmalar Lactobacillus türleri, Clostridium türleri, Peptostreptococci ve Escherichia Coli; β-glukozidaz üreten mikroorganizmalar Bifidobacterium, Bacteriodes ve Clostridium türleridir. Yenidogan ve süt çocuklugu döneminde diski enzim aktivitesini etkileyen faktörleri inceleyen sinirli sayida çalisma vardir (5,6,7,6,7,8). Ilk çalisma sonuçlari diski barsak enzim aktivitesinin beslenme sekli (anne sütü ve formüla) ve fizyolojik olgunlasma ile yasla degistigi yönünde olmustur (5,6,7). Diski barsak enzimlerinin aktivitesinin dogum sekli (vajinal dogum ve sezaryen) ve antibiyotik kullanimi ile etkilendigini gösteren çalismalar da vardir (5). Çalismamizin amaci bebeklerde diski enzim aktivitelerinin (β-glukuronidaz, β-glukozidaz ve üreaz) anne sütü aldiklari dönemde (6 haftalikken) ve tamamlayici beslenmeye geçtikten sonraki dönemde (8. ayda) nasil degistigini ve bu degisimi etkileyen anneye ait (yas, egitim, sigara kullanimi, anemi vb.) ve bebege ait (cinsiyet, dogum haftasi, dogum agirligi, dogum sekli, beslenme sekli, emzik kullanimi, D vitamini kullanimi vb.) faktörleri belirlemektir. Ayrica bakteri enzim aktivitesi ile büyüme parametreleri arasinda iliski varligi arastirilmistir.

Gereç ve Yöntem

Çalismaya 100 saglikli 6 haftalik bebek alindi. Alti haftalikken alinan diski örneklerinin 17’si partikülsüz olmasi nedeni ile analiz yapilmadi. Çalismaya alinan çocuklarin 35’inden 8. ayda ikinci diski örnegi alindi. Çocuklarin 25’inin hem 6 haftalik hem de 8 aylik diski örnekleri vardi. Bebekler dogum agirligi açisindan 2,500 gramdan küçük doganlar ve 2,500 gram ve üstü doganlar olarak ikiye ayrildi. Dogum haftasi açisindan gestasyon haftasi 37 haftadan kisa olanlar ve 37 hafta ve sonrasinda doganlar olarak ikiye ayrildi. “Sadece anne sütü” verme durumu ilk 1,5 ay içinde bebege anne sütü disinda baska bir sivi ve yiyecek verilmemis olmasi olarak tanimlandi. Dünya Saglik Örgütü, Çok Merkezli Büyüme Egrileri kullanilarak bebeklerin dogum agirligi, 1,5 ay ve 8. ay agirlik ve boy kilo ölçümleri ile vücut kitle indeksi z skorlari hesaplandi (10). Çalisma için Hacettepe Üniversitesi Tip Fakültesi’nden etik kurul onayi alindi. Tüm bebeklerin ailesinden çalismaya alinmadan önce çalisma hakkinda bilgi verilip onam formu imzalatildi. Barsak Enzim Aktivitesinin Ölçümünde Kullanilan Metotlar Her bir diski örnegi analiz edilinceye kadar -20 °C’de dondurularak saklandi. Ölçümler örnekler toplandiktan sonraki iki ay içinde yapildi. Diski enzim aktivitesi ölçümünde islem basamaklari asagida belirtilmistir (11-13). 1. Gaitanin Hazirlanmasi: Taze gaita örnekleri önceden tartilmis tüplere konularak 1:10 (w/v) oraninda 0,1 M pH 7,0 potasyum fosfat tamponu ile karistirildi. Otuz saniye sonikasyonun ardindan 2000 xg’de 5 dakika santrifüj edildi ve süpernatan ayrildi. pH, protein tayini ve enzim analizi için kullanildi. 2. pH Tayini: pH kagidi kullanilarak süpernatanda ölçüldü. 3. Lowry Yöntemi ile Protein Tayini: 10 uL süpernatan 140 uL su ile karistirildi. Üzerine 3 mL alkalen bakir çözeltisi (50 mL 0,1 N NaOH içinde çözülmüs %2 Na2CO3 ile 1 mL %1 sodyum veya potasyum tartrat içinde çözülmüs %0,5 CuSO4.5H2O karistirildi) eklendi. On bes dakika oda sicakliginda inkübe edildikten sonra 1:1 v/v olarak seyreltilmis Folin-Ciocalteau çözeltisinden 0,3 mL eklenerek karistirildi. Oda sicakliginda 1 saat inkübasyonun ardindan olusan mavi-mor renk 750 nm’de spektrofotometrede okundu. Standart olarak sigir serum albumini kullanildi. 4. Üreaz Enzimi Aktivite Tayini: 1 mL 0,02 M pH 7,4 potasyum fosfat tamponu içinde hazirlanmis 10 mM üre ile 0,2 mL süpernatan karistirildi. 37 °C’de 30 dakika inkübe edildikten sonra, tüpler buz içine alinarak reaksiyon durduruldu. Olusan amonyak 0,01 N HCl ile titre edilerek parçalanan üre miktari üzerinden enzim aktivitesi tayin edildi. 5. β-glukuronidaz Enzimi Aktivite Tayini: 1 mL 0,1 M pH 7,0 potasyum fosfat tamponu içinde hazirlanmis 0,5 mM p-nitrofenil β-D-glukuronid ile 0,1 mL süpernatan karistirildi. 37 °C’de 30 dakika inkübe edildi. Reaksiyon 4 mL 0,1 N NaOH ile durduruldu. Açiga çikan p-nitrofenol 405 nm’de okundu. Standart olarak p-nitrofenol kullanildi. Sonuçlar nmol/dakika/mg gaita proteini olarak ifade edildi. 6. β-glukozidaz Enzimi Aktivite Tayini: 1 mL 0,1 M pH 7,0 potasyum fosfat tamponu içinde hazirlanmis 1 mM p-nitrofenil β-D-glukosid ile 0,1 mL süpernatan karistirildi. 37 °C’de 60 dakika inkübe edildi. Reaksiyon 5 mL 0,1 N NaOH ile durduruldu. Açiga çikan p-nitrofenol 405 nm’de okundu. Standart olarak p-nitrofenol kullanildi. Sonuçlar nmol/dakika/mg gaita proteini olarak ifade edildi. Istatistiksel Analiz Veriler SPSS-Windows (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) versiyon 17.0 programina kaydedilerek analiz edildi. Verilerin dagilimlari Kolmogrov Smirnow testi ile incelendi. Diski enzim düzeyleri normal dagilima uymadigi için ortanca ve 25-75 persentil degerleri hesaplandi. Bagimsiz iki grup arasindaki farkin karsilastirilmasinda Mann Whitney U testi, üç grup arasindaki farkin karsilastirilmasinda Kruskal-Wallis H testi kullanildi. Diski enzim aktivitesinin 6. hafta ve 8. ay degerlerinin zaman içindeki degisimi veriler normal dagilima uymadigi için nonparametrik bagimli iki grup ortancalarini karsilastiran Wilcoxon testi kullanildi. Antropometrik ölçümlerin z skorlari ile diski enzim aktivitelerinin iliskisi spearman korelasyon testi ile analiz edildi. P<0,05 oldugunda gruplar arasindaki fark istatistiksel olarak anlamli kabul edildi.

Bulgular

Diski enzim aktiviteleri 83 bebekte 6 haftalikken, 35 bebekte 8 aylikken ölçüldü (Tablo 1). Bir buçuk aylikken ortanca üreaz (25-75 persentil): 0,97 (41) (nmol/dakika/mg-gaita) iken, 8. ayda 0,7 (89) (nmol/dakika/mg-gaita) idi. Zaman içindeki azalma istatistiksel olarak anlamli idi (27). Bir buçuk aylikken ortanca β-glukuronidaz (25-75 persentil): 11,8 (8) (nmol/dakika/mg-gaita) iken, 8. ayda 6,94 (3,4) (nmol/dakika/mg-gaita) idi. Zaman içindeki azalma istatistiksel olarak anlamli idi (1). Bir buçuk aylikken ortanca beta-glukozidaz (25-75 persentil): 6,13 (3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95) nmol/mg-protein/dk iken, 8. ayda 8,83 (5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65) (nmol/dakika/mg-gaita) idi. Zaman içindeki artma istatistiksel olarak anlamliydi (12). Anne-bebek çiftinin özellikleri ile 6 hafta-8. ay diski enzim düzeyleri (üreaz, β-glukuronidaz, β-glukozidaz) arasindaki iliski incelendiginde anne yasi, egitimi, postpartum maternal anemi, gebelikte ve 6. haftada sigara kullanimi, cinsiyet, dogum agirligi, dogum sekli bakimindan farkli olmadigi görüldü (Tablo 2). Dogum haftasi 37 haftadan küçük olanlarin 8. ay β-glukuronidaz düzeyi 37 haftadan büyük olanlardan daha yüksekti (8). Bebeklerin beslenme durumlari ile diski enzim aktiviteleri iliskisine bakildiginda 6. haftada sadece anne sütü alma durumu, emzik kullanimi, D vitamini kullanimi ile diski enzim aktiviteleri arasinda iliski olmadigi görüldü. Bununla birlikte anne sütünü dogumdan sonraki ilk 1 saat içinde alan bebeklerin 6. hafta üreaz ortanca degerleri almayan bebeklere göre daha düsüktü (17). Biberon kullanan bebeklerde üreaz ortanca degerleri kullanmayanlara göre daha düsüktü (26). Antropometrik ölçümlerin z skorlari ile diski enzim aktivitelerinin iliskisi incelendiginde 6. hafta β-glukuronidaz enzim aktivitesi ile 8. ay yasa göre agirlik z skoru, yasa göre vücut kitle indeksi ve boya göre agirlik z skoru arasinda negatif korelasyon saptandi (33). Diger antropometrik ölçümlerle diski enzim aktivitesi arasinda istatistiksel olarak anlamli iliski gösterilemedi (Tablo 3).

Tartisma

Farkli yas gruplarinda hangi tür bakterinin agirlikli olarak mikrofloraya hakim oldugu kullanilan tani yöntemine göre degismekle beraber klasik olarak yenidoganin mikrobiotasinda 3. haftadan itibaren Staphylococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium ve Clostridium cinsinden bakterilerin gözlendigi; anaerob hakimiyetinin (Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium’lar) giderek artarak, 52. haftaya kadar varliklarini korudugu belirlenmistir (14). Çalismamizda saptanan enzim aktivitesindeki degisimler (üreaz ve β-glukuronidaz enzim aktivitesindeki zaman içinde azalma, β-glukozidaz enzim aktivitesinde artma) bu klasik bilgiyi dogrular niteliktedir. Mykkanen ve ark. (5) 3 ay-2 yas arasinda bebeklerde ölçtükleri üç diski enzim aktivitesinin zaman içinde arttigini bildirmislerdir. Bu durumu yas ve eriskin diyete geçisle iliskili olabilecegini belirtmislerdir. Anne sütü ile beslenen bebeklerde mikroflora faydali organizmalar olarak bilinen Bifidobacteria ve Lactobacilli’lerin hakimiyetindedir ve zararli olarak tanimlanan bakterilerin üremesini baskilarlar (15). Mama ile beslenen bebeklerde ise Escherichia Coli, C difficile, Bacteroides ve Lactobacilli’ler mikrofloraya hakimdir (16). Grönlund ve ark. (7) formüla ile beslenen bebeklerde sadece anne sütü ile beslenen bebeklere göre 1-2. ayda diski üreaz pozitifligini ve 6. ayda ortalama β-glukuronidaz aktivitesini daha yüksek bulduklarini bildirmislerdir. Mykkanen ve ark. (5) 3. ay-2 yas araligindaki bebeklerde ölçtükleri diski enzim aktivitelerinin anne sütü ile beslenme arasinda iliski olmadigini bulmuslardir. Çalismamizda bebeklerin 6 haftalikken sadece anne sütü almalarinin enzim aktivitesinden etkilenmedigi saptanirken, anne sütünü ilk 1 saatten sonra almaya baslayan ve biberon kullanmayan bebeklerde üreaz aktivitesi daha yüksek saptanmistir. Biberon kullanimi mama kullanimi ile es kullanilmakla beraber bazen emmeyen bebeklerde anneler sütlerini sagip biberonla da verebilmektedirler. Sonucun çeliskisi buradan kaynaklaniyor olabilir. Pretermlerin mikroflorasi ile ilgili çalismalarda faydali mikroorganizmalarin kolonizasyonunun geciktigi yönündedir (15). Çalismada prematür dogan bebeklerin 8. ay β-glukuronidaz enzim aktivitesi term bebeklere göre daha yüksek saptanmasi mikroflora yapilanma ve fonksiyon kazanma zamanindaki farkliliktan kaynaklanabilecegini düsündürmektedir. Ayrica çalismamizda mikroflorayi etkiledigi gösterilen hastane yatisi, yatis süresi, sepsis, nekrotizan enterokolit geçirme öyküsü, antibiyotik kullanimina dair veri toplanmamistir. Bu nedenle prematüre bebeklerde β-glukuronidaz enzim aktivitesinin yüksekligini mikroflora örüntüsünün niceligine atfetmek zordur. Dogumun sezaryen ile yapilmasi yenidogan bebeklerin flora olusumunu olumsuz etkiledigi bilinmektedir (16). Bununla birlikte çalisma grubumuzda üç barsak enzim aktivitesinin de dogum seklinden etkilenmedigi görülmüstür. Grönlund ve ark.’da (7) 1,5-6. aylarda degerlendirdikleri intestinal enzim aktivitelerinin sezaryen dogum seklinden etkilenmedigini bildirmislerdir. Barsak florasinda kompozisyon ve fonksiyonel degisikliklerin obezite ve obezite iliskili komplikasyon gelisimine katkida bulundugu son yillarda gösterilmistir. Özellikle obez kisilerde tercih edilen yüksek yagli diyet sonucu mikrofloranin degisime ugradigi gösterilmistir. Barsak mikroflorasinda yer alan mikroorganizmalarin kompozisyonundaki degisiklik (bacteriodeste azalma, firmicutes türlerinde artis) enerji depolanmasini ve yag kitlesi gelisimini saglayarak obeziteye neden olurlar (17). Çalismamizda büyüme parametreleri ile diski enzim aktivitesi arasinda iliski 6. hafta β-glukuronidaz enzim düzeyi ile 8. ay yasa göre agirlik z skoru, vücut kitle indeksi z skoru, boya göre agirlik z skoru arasinda ters bir korelasyon saptandi. Hayatin erken döneminde β-glukuronidaz enzim aktivitesinin az olmasi ilerleyen aylarda kiloluluk/obezite ihtimalini arttirdigi sonucuna ancak daha fazla sayida olgu, uzun süreli izlem ile karistirici degiskenlerin kontrol edildigi çalismalarla varilabilir.

Sonuç

Intestinal enzim aktiviteleri süt çocuklugu döneminde yapilanma asamasinda olan mikrofloranin fonksiyonelligini dolayli olarak göstermesi açisindan önemlidir. Bununla birlikte yasla beraber degiskenlik göstermesi ve tek ölçümle elde edilen degerlerin zamanla ne yönde degiseceginin kestirilmesi zordur. Bazi büyüme parametreleri ile intestinal barsak enzimleri arasinda iliski gösterilmesinin bebegin büyüme sürecinde ne anlam kazanacagi ileriye dönük yapilacak çalismalarla aydinlatilabilir. Etik Etik Kurul Onayi: Alinmistir, Hasta Onayi: Alinmistir. Hakem Degerlendirmesi: Editörler kurulu disinda olan kisiler tarafindan degerlendirilmistir. Yazarlik Katkilari Konsept: Songül Yalçin, Dizayn: Songül Yalçin, Veri Toplama veya Isleme: Incilay Lay, Asuman Özkara, Emel Örün, Arzu Dursun, Analiz veya Yorumlama: Emel Örün, Songül Yalçin, Literatür Arama: Emel Örün, Songül Yalçin, Yazan: Emel Örün, Songül Yalçin. Çikar Çatismasi: Yazarlar bu makale ile ilgili olarak herhangi bir çikar çatismasi bildirmemistir. Finansal Destek: Çalismamiz için hiçbir kurum ya da kisiden finansal destek alinmamistir.